在單細(xì)胞水平解析組織空間異質(zhì)性及其分子空間表達(dá)模式的空間組學(xué)是生命科學(xué)研究的關(guān)鍵前沿技術(shù)，其多組學(xué)拓展廣度與高通量檢測(cè)深度已為各研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題帶來了新的發(fā)現(xiàn)與見解。目前空間組學(xué)按照技術(shù)路線可分為基于測(cè)序（Sequencing-based spatial transcriptomics，sST）捕獲和基于成像（imaging-based spatial transcriptomics，iST）兩大類?；?/span>測(cè)序的空間組學(xué)方法可進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的捕獲，且部分方法可拓展至多組學(xué)，但缺乏真正的單細(xì)胞分辨率，而且檢測(cè)效率低下、成本較高、批間差異較大，重構(gòu)的空間組學(xué)圖像實(shí)質(zhì)為2D馬賽克間斷式平面圖片；基于成像的空間組學(xué)方法具有亞細(xì)胞分辨率，且捕獲效率高，部分方法兼容多組學(xué)，可利用成像實(shí)現(xiàn)3D無間斷空間組學(xué)，但大多數(shù)方法為靶向空間組，全轉(zhuǎn)錄組模式下捕獲效率較低，多輪成像光毒性大，高密度信號(hào)解析困難。因此各種空間組學(xué)方法都亟待進(jìn)一步升級(jí)，以滿足科研對(duì)空間組真正單細(xì)胞高分辨、高捕獲率、高重復(fù)性的迫切需求。

2024年5月14日，鯤羽生物核心研發(fā)團(tuán)隊(duì)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《Nature Biomedical Engineering》在線發(fā)表了題為“Spatial multi-omics at subcellular resolution via high-throughput in situ pairwise sequencing”的研究成果，介紹了一種基于成像的新型空間組學(xué)技術(shù)——多組學(xué)雙端原位測(cè)序技術(shù)（Multiomics in situ Pairwise sequencing, MiP-seq），能夠在亞細(xì)胞分辨率下同時(shí)高效地解析多重DNA、RNA、蛋白質(zhì)和功能小分子的多維空間組學(xué)3D圖譜，可以兼容轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、拉曼成像、鈣離子成像多個(gè)模態(tài)信息檢測(cè)，展示了其在空間多組學(xué)中的巨大應(yīng)用潛力。

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-024-01205-7#citeas

圖1. MiP-seq的技術(shù)原理及流程示意圖

相較于目前主流的空間組技術(shù)，MiP-seq具備以下幾個(gè)方面的方法創(chuàng)新與技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1）雙條形碼鎖式探針與雙端測(cè)序策略

MiP-seq采用雙條形碼鎖式探針設(shè)計(jì)和雙端測(cè)序策略。與傳統(tǒng)的單條形碼鎖式探針和單端測(cè)序策略相比，雙條形碼編碼策略能夠在每個(gè)輪次內(nèi)對(duì)十種不同的序列組合進(jìn)行編碼，增加了信號(hào)解碼的能力。以更少輪次實(shí)現(xiàn)更高通量的方式，使得測(cè)序和成像成本大幅降低，同時(shí)顯著縮短成像時(shí)間，從而較大限度減少光毒性。

2）獨(dú)特探針設(shè)計(jì)與高效檢測(cè)效率

與傳統(tǒng)的原位測(cè)序方法相比，MiP-seq通過改進(jìn)探針結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化生化反應(yīng)體系顯著提高了原位測(cè)序檢測(cè)效率。通過與smFISH的HCR3.0進(jìn)行比較，對(duì)特定基因的檢測(cè)效率可高達(dá)96%。同時(shí)，基于高效的檢測(cè)效率和獨(dú)特的探針設(shè)計(jì)，MiP-seq可以實(shí)現(xiàn)在DNA 和 RNA水平的單堿基突變的原位檢測(cè)，并進(jìn)一步可以區(qū)分RNA水平上的 m6A修飾，從而具備了空間多組學(xué)的擴(kuò)展?jié)摿Α?/span>

3）單細(xì)胞分辨率空間轉(zhuǎn)錄圖譜繪制

通過MiP-seq技術(shù)，團(tuán)隊(duì)人員繪制了小鼠下丘腦斜角帶水平支（HDB）中100個(gè)基因的空間表達(dá)圖譜，這些基因基本覆蓋了常見細(xì)胞類型marker基因與相關(guān)功能基因。同時(shí)基于MiP-seq研究了小鼠下丘腦室旁核（PVN）響應(yīng)外周結(jié)核分枝桿菌（M.tb）感染的空間轉(zhuǎn)錄組變化，解碼了217個(gè)基因的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，并確定了對(duì)感染反應(yīng)的調(diào)控基因。MiP-seq為更實(shí)用、更高效、更高清的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜繪制提供了新的解決方案。

圖2. 小鼠HDB核團(tuán)100個(gè)基因單細(xì)胞分辨率空間圖譜的繪制

4）大視野與3D結(jié)構(gòu)下基因空間表達(dá)構(gòu)筑

基于MiP-seq，團(tuán)隊(duì)人員成功繪制了小鼠大腦整個(gè)矢狀面中多基因的空間表達(dá)圖譜，實(shí)現(xiàn)了大視野下全腦范圍內(nèi)的成像與圖譜繪制；此外，通過連續(xù)切片與重構(gòu)模擬的方式展示了在3D結(jié)構(gòu)下多基因在整個(gè)小腦中的表達(dá)和分布情況。更進(jìn)一步的，基于MiP-seq可不通過連續(xù)切片的方式直接在完整斑馬魚端腦中解析多個(gè)基因的表達(dá)與位置信息，實(shí)現(xiàn)真正3D結(jié)構(gòu)下分子空間圖譜，將傳統(tǒng)基于切片的二維平面空間圖譜提升到了三維立體空間構(gòu)筑。

圖3. 大視野與3D結(jié)構(gòu)下腦組織基因表達(dá)譜空間構(gòu)筑

5）空間多組學(xué)的擴(kuò)展應(yīng)用

MiP-seq不僅可以針對(duì)轉(zhuǎn)錄組水平還可以擴(kuò)展至其他組學(xué)水平（基因組、蛋白組等），實(shí)現(xiàn)空間多組學(xué)圖譜的繪制。MiP-seq通過抗體-核酸偶聯(lián)的方式，將抗體信息與蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)等分子信息轉(zhuǎn)換成barcode序列信息，從而可以實(shí)現(xiàn)在亞細(xì)胞分辨率下在同一個(gè)細(xì)胞里對(duì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的共同檢測(cè)，以繪制多組學(xué)層次的生物分子空間景觀。

圖4. 應(yīng)用MiP-seq解析彌漫性大B淋巴瘤組織樣本中30種蛋白及6種mRNA的空間分布

6）多種功能成像技術(shù)的兼容整合

MiP-seq能夠與拉曼成像和活體Ca²⁺成像等多種功能成像技術(shù)兼容，在空間多維層次分析上具有巨大的應(yīng)用潛力，特別是具有多維信息的組織圖譜解析，以及對(duì)細(xì)胞表達(dá)譜與分子功能的關(guān)聯(lián)解析能力。團(tuán)隊(duì)人員通過MiP-seq技術(shù)與活體Ca²⁺成像聯(lián)合使用，獲得了小鼠視覺皮層中神經(jīng)元的基因表達(dá)與功能活動(dòng)的關(guān)聯(lián)信息，實(shí)現(xiàn)了從基因到功能的整合分析。

圖5. MiP-seq技術(shù)與活體Ca²⁺成像技術(shù)兼容與整合分析

7）稀釋策略解決光信號(hào)擁擠

光信號(hào)擁擠是幾乎所有基于成像空間組學(xué)方法都會(huì)面臨的“頭疼”問題。MiP-seq提出了一種序列稀釋策略，通過使用一組測(cè)序引物和錨定基因引物來進(jìn)行信號(hào)的稀釋分批解讀，從而解決信號(hào)擁擠問題，以時(shí)間換空間，提高了高密度信號(hào)的解析準(zhǔn)確性。

圖6. 用于解決光學(xué)信號(hào)擁擠的稀釋策略

綜上所述，MiP-seq技術(shù)為生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了新的解決方案，該技術(shù)在捕獲策略、解碼通量、靶標(biāo)檢測(cè)范圍、高密度成像、SNV、RNA修飾、功能成像整合分析等多方面進(jìn)行了優(yōu)化與擴(kuò)展。相較于傳統(tǒng)的空間組學(xué)方法，MiP-seq具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和擴(kuò)展應(yīng)用，在靶向空間多組學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值和前景。這種高效的空間多組學(xué)方法將為發(fā)育生物學(xué)、腦科學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域提供更精準(zhǔn)的高空間分辨率的多維空間圖譜。

MiP-seq目前已經(jīng)進(jìn)行了技術(shù)轉(zhuǎn)化與商業(yè)推廣，并基于以上技術(shù)特點(diǎn)與應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，推出了一系列的空間組學(xué)解決方案，服務(wù)基礎(chǔ)科研與臨床診斷。我們希望通過以生物大分子的原位實(shí)景還原方式來解析細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，推動(dòng)對(duì)生物系統(tǒng)復(fù)雜性的理解和疾病機(jī)制的探索，為生命科學(xué)探索與下一代分子病理診斷提供更全面的信息支撐與檢測(cè)利器。