（一）產品介紹

1.產品名稱

通用名稱：產前染色體數(shù)目檢測試劑盒

英語名稱：FISH kit for the detection of chromosome numbers in prenatal diagnosis

2、包裝規(guī)格

3、產前檢測對象

孕婦有以下情況者，可考慮采用本試劑盒用于產前檢測：

（1）高齡產婦及在早孕期反復自然流產

（2）存在即往出生缺陷病史、家族分子遺傳病史及神經(jīng)管缺陷家族史

（3）妊娠合并1型糖尿病、高血壓、癲癇、哮喘

（4）曾暴露于藥物、病毒、環(huán)境危害等不良環(huán)境中的妊娠產婦

（5）父母存在近親的情況

（6）懷孕3個月后超聲波檢查發(fā)現(xiàn)胎兒嚴重異常

（7）孕婦年齡、血清學篩查或超聲波檢查發(fā)現(xiàn)其屬于常染色體三體高危人群

4、適檢孕期

可以在妊娠16周左右進行羊膜穿刺術，也可以在妊娠9-11周時進行絨毛膜絨毛取樣檢測。通過檢測羊水細胞中 13 號、18 號、21 號、X 及 Y 染色體數(shù)目的異常，為產前染色體遺傳性疾病的診斷提供依據(jù)。

5、檢測疾病簡介

21 號染色體三體（Down 綜合癥）、18 號染色體三體（Edward 綜合癥）、13 號染色體三體（Patau 綜合癥）、XO（Turner 綜合癥）、XXY（Klinefelter 綜合癥）、XXX 及 XYY 等 7 種遺傳性疾病，主要是由于人類 21號、18 號、13號、X 及 Y 染色體數(shù)目異常而導致。而本產品主要用于檢測羊水細胞中21號、18號、13號、X 及 Y 染色體的數(shù)目的異常變化所引起的疾病，主要如下：

（1）21號染色體三體（Down綜合癥）

21三體或唐氏綜合癥（Down syndrome (DS)），是由一條額外的染色體產生的，這條額外的染色體隨后被標記為 21 號，因此在臨床發(fā)生這種情況被稱為 21三體。這是一種常見的染色體缺陷病，是常見、容易辨認的一種智力缺陷，大約每700名新生兒中就有一人患有這種缺陷，俗稱先天愚型。唐氏綜合癥發(fā)生率與母親懷孕年齡有相關，母齡高，卵子老化是發(fā)生不分離的重要原因；21號染色體的異常主要有三體、易位及嵌合3種類型。從 21q21 -21q22.3的這個區(qū)域被稱為唐氏綜合癥關鍵區(qū)域 (DCR)。

（2）18 號染色體三體（Edward 綜合癥）

18三體綜合癥，愛德華氏綜合征(Edward syndrome)，是由于個體多一條18號染色體引起。主要發(fā)生于新生嬰兒，其發(fā)生率為 1/6000 至 1/8000?；颊吲R床表現(xiàn)出重度智力低下，發(fā)育遲緩，新生兒期肌張力增強，以及多器官畸形，90％有心臟畸形，以室間隔缺損常見，其他有房間隔缺損、動脈導管未閉等。18三體綜合癥發(fā)生的主要機理是生殖細胞減數(shù)分裂過程中18號染色體不分離，超過90％起源于母方，且不分離大多發(fā)生在卵子減數(shù)分裂II期，與孕婦年齡有關。發(fā)生這種疾病的嬰兒壽命一般很短，只有5-10%的嬰兒活過了一歲。

（3）13 號染色體三體（Patau綜合癥）

13三體綜合癥，又叫帕托綜合癥(Patau syndrome)，是一種較為常見的染色體畸變疾病。在新生兒中的發(fā)病率占1/25000，并與一種特殊的畸形和嚴重的神經(jīng)發(fā)育障礙的分布有關。大多數(shù)在分娩后即可死亡，只有6-12%患Patau綜合癥的嬰兒能活過一歲，其中樞性呼吸暫停是造成壽命短的主要原因。大多數(shù)患兒以小顱、頭皮缺損、小眼球、腭裂等多發(fā)畸形為特征；并有嚴重的腦發(fā)育異常、先天性心臟病、唇腭裂、腹壁發(fā)育有畸形等，其殘疾程度超過Down綜合癥。大約90%的13三體是由于母體減數(shù)分裂Ⅰ期的不分離造成的，其次就是母親年齡偏大，卵子老化等原因引起。

（4）XO（Turner 綜合癥）

Turner綜合癥（Turner syndrome）也稱為先天性卵巢發(fā)育不全綜合癥，是為常見的人類染色體異常疾病之一。由于全部或者部分體細胞中缺乏一條x染色體所致，此病主要見于女孩。Turner綜合癥患者核型復雜多樣，根據(jù)染色體核型分析可分為4類：45,X單體，嵌合體，X染色體結構異常，含有Y染色體或來源于Y染色體的片段；80%患者的染色體核型分析顯示為45,X單體。該病是唯.一出生后能存活的完全單體病人，其發(fā)病率為1/2000-1/2500活產女嬰。該病的臨床特征主要表現(xiàn)為身材矮小、生長落后，性發(fā)育不良、原發(fā)性閉經(jīng)，特殊的軀體特征如頸蹼、肘外翻等。

（5）XXY（Klinefelter 綜合癥）

Klinefelter綜合癥( Klinefelter Syndrome)又稱先天性睪丸發(fā)育不全，是較常見的一種性染色體畸變的遺傳病，是男性不育癥常見的遺傳學病因之一。該病主要是由于卵子或者精子在減數(shù)分裂時不分離或受精卵在有絲分裂時不分離，從而導致胎兒多出一條X染色體。在男性新生兒中發(fā)病率約為1/1000，常見的染色體核型為：47,XXY，嵌合型為：46,XY/47,XXY。本病特點表現(xiàn)為睪丸小而堅實、男性乳房發(fā)育、第二性特征發(fā)育不全、無精子及尿中血促性腺激素增高等。

（6）XXX

XXX綜合癥也稱為"X3綜合癥"或"超雌綜合癥"，為女性常見的X染色體異常疾病。該病的發(fā)生率為1/1000-1/2000，主要因為母親的生殖細胞在第二次分裂減數(shù)后期，性染色體著絲點未分開，導致產生基因型為XX的卵細胞，與父親產生的正?；蛐蜑閄的精子結合，產生基因型為XXX的合子；或父親的生殖細胞在第二次分裂減數(shù)后期，性染色體著絲點未分開，導致產生基因型為XX的精子，與母親產生的正?；蛐蜑閄的卵細胞結合，產生基因型為XXX的合子。其臨床特征表現(xiàn)為輕度到中度的智力障礙、眼距寬、面部發(fā)育不全、語言發(fā)育遲滯等，且多數(shù)患者表現(xiàn)為生育能力低下或無生育能力。

（7）XYY

XYY綜合癥(XYY syndrome)又名YY綜合征或超雄綜合癥，它是一種性染色體異常綜合癥，該病在新生男嬰中的發(fā)病率為1/750-1/15000。主要是因為父親的生殖細胞減數(shù)分裂時，染色體不分裂使精子有兩條Y染色體；同時該精子和卵子結合，使受精卵存在兩條Y染色體所致。其臨床特征表現(xiàn)為身材高大、肌張力低、動作不協(xié)調、面部不對稱；個性殘暴、易激惹、經(jīng)受不住挫折，當處境不利時易于發(fā)生社會適應不良或伴發(fā)精神障礙

6、檢驗原理

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是近年來在分子細胞遺傳學領域發(fā)展起來的一種方法，它可以快速檢測胎兒染色體異常增加或者缺失。FISH技術是利用熒光標記的特異性寡核苷酸片段作為探針，與染色體、細胞或組織中的核酸按照堿基互補配對原則進行雜交，通過熒光系統(tǒng)檢測，對待測DNA進行定性或相對定位分析。根據(jù)目前臨床醫(yī)學的研究，染色體異常的活嬰95%是由于21號、18號、13號、X、Y染色體非整倍體數(shù)目異常造成。本實驗主要利用著絲粒特異性探針的FISH快速檢測羊膜穿刺術后的非整倍體。通過穿刺搜集的羊水細胞，經(jīng)過一系列預處理實驗后，即進行熒光原位雜交試驗，再利用熒光顯微鏡觀察檢測結果并分析即可。研究結果表明，F(xiàn)ISH 檢測這些染色體疾病的靈敏度及特異性均在 99% 以上。

7、臨床意義

通過產前診斷可以從孕婦中發(fā)現(xiàn)懷有某些先天缺陷兒的高危孕婦，以便進一步明確診斷，對可治性疾病，選擇適當時機進行宮內治療；對于不可治療性疾病，能夠做到知情選擇。而FISH在羊膜穿刺術后24-48小時內，甚至幾小時即可觀察檢測結果，這縮短了采樣和診斷之間的時間間隔；因此對緊急高危妊娠的產前診斷具有重要價值。這項技術的檢測速度和可靠性大大縮短了臨床醫(yī)生和產婦的等待時間。

8、主要組成成分

探針光譜數(shù)據(jù)

9、儲存條件及有效期

（1）儲存條件：-20℃ ±3℃避光、密封儲存，產品有效期為自生產之日起一年；避免反復凍融；開封后，24 小時內可在 2-8℃避光、密封儲存；使用后的剩余試劑應自開封 24 小時內繼續(xù)在 -20℃ ±3℃避光、密封儲存；不應與有毒、有污染和有不良氣味的物品混存。

（2）生產日期：見產品標簽。

（3）產品有效期：見產品標簽。

10、適用儀器

（1）試驗儀器：熒光顯微鏡，所需熒光顯微鏡的配置包括：10×目鏡，10×、40×物鏡和100×油鏡。

（2）試驗染料：本試劑盒選用Cy3-DUTP橙紅色熒光、Fluorescein-DUTP綠色熒光、DAPI藍色熒光進行標記，建議顧客使用探針前向濾片組供應商了解所使用的濾片組的詳細情況，以便選擇與標記熒光染料相適應的濾片組。

11、樣本要求

（1）需要新鮮采集的樣本5-10ml且未經(jīng)培養(yǎng)的羊水用于 FISH 實驗玻片制作。

（2）避免樣本污染：用于檢測的羊水樣本應避免母體血細胞污染，以防止由此可能產生的假陽性或假陰性檢測結果 ；具體措施為 ：將收集的羊水樣本離心沉淀后，血細胞層不能超過整個細胞沉淀層的一半，否則該樣本應丟棄。

（3）收集的羊水樣本應迅速、及時地處理，不要過夜。

（4）樣本要避免溫度過高和過低，可短時間存放于 4℃冰箱，不能凍存。

（二）檢驗方法

所需試劑及配制

1、20×SSC，pH5.3

可向公司購買使用，也可自行配置，配方如下

1）20×SSC：氯化鈉88g、檸檬酸鈉44g、去離子水400ml，三者混勻充分溶解，室溫下12M HCl 調節(jié)pH值至5.3，用去離子水定容至500ml，高壓滅菌。

2）2×SSC：體系50ml，20×SSC（pH5.3）10ml,、去離子水40ml，混勻后調節(jié)PH至7.0±0.2

注意：使用期間 2-8℃儲存。保存期不要超過 6 個月，若試劑出現(xiàn)混濁或污染應丟棄。

2、甲醇/冰乙酸固定液（3:1）：現(xiàn)配現(xiàn)用

體系4ml：甲醇原液3ml、冰乙酸原液1ml，混勻，靜置備用。注意：甲醇易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物；冰乙酸屬低毒類，有刺激性氣味，因此在配制固定液時需在通風櫥中進行。

3、乙醇溶液配置（70％乙醇、85％乙醇、100％乙醇）

將700ml、850ml 無水乙醇用去離子水分別稀釋至1L，使用期間2-8℃儲存。

注意：試劑配制1個月后或試劑出現(xiàn)混濁或污染應丟棄。

4、膠原酶 B（0.005g / 5ml Hank's BSS）

稱取膠原酶 B（SIGMA C6885）5mg，用 5ml Hank's BSS液溶解，37oC 攪拌溶解 1 小時，4℃過夜，濾過消毒，-20℃分裝儲存

5、洗滌液配方：體系為500ml

1）0.3%NP40/0.4xSSC：10ml 20XSSC 、490ml ddH2O、1.5 ml NP40，混勻后調節(jié)PH至7.5，4℃保持。該試劑用于雜交后第一次洗脫，需72℃預熱。

2）0.1%NP40/2xSSC：50ml 20XSSC 、 450ml ddH2O、0.5 ml NP40，混勻后調節(jié)PH至7.5，4℃保存。該試劑用于第二次洗脫，室溫即可。

6、KCl低滲溶液（0.075 M KCl）

KCl 2.795g，去離子水 300ml

7、100μg/ml 的RNase A

1）配制RNase A儲存溶液（1 mg/ml）：溶解0.001gRNase A于1ml 2×SSC（pH 7.0）中，煮沸10min，冷卻至室溫，-20℃分裝儲存。

2）配制 RNase A 工作溶液（100μg/ml）：取 100μl RNase A 儲存溶液（1mg/ml）

于 900μl 2×SSC（pH 7.0）中，混勻，-20℃分裝儲存

8、HCl的配制

1）1MHCL：濃 HCl 8.2ml，去離子水 80ml，用去離子水定容至 100ml，室溫儲存。

2）0.1M HCl：取5ml 1M HCl，加去離子水定容至50ml

3）0.01M HCl：取0.4ml 1M HCl，加去離子水定容至40ml。

注意：試劑配制 1 個月后應丟棄，若試劑出現(xiàn)混濁或污染應丟棄。

9、20mg/ml 的胃蛋白酶儲存溶液

溶解 20mg 胃蛋白酶（Sigma, P7000）于 1ml 無菌水中，煮沸 15 min，冷卻至室溫，-20℃分裝儲存

10、雜交液制備

1ul探針DNA，0.5ul cot1DNA，0.5ul 魚精DNA，1ul 20xSSC，5ul甲酰胺，2ul 葡聚糖（40%），混勻備用。

樣本預處理程序

1、5-10ml羊水在 1200rpm 下離心 10 min后，去上清。用 1.5-5ml 膠原酶 B

（0.005g/5ml Hank's BSS）重新吹打懸浮細胞。

2、置 37℃水浴箱中 20 min。

3、1000rpm離心 10 min，去上清，加 2-5ml KCl 低滲溶液（KCl 低滲溶液使用前在 37oC 水浴中預熱 30 min）重新吹打懸浮細胞，置 37℃水浴箱中孵育 20min。

4、緩慢加 2 ml 固定液（甲醇 : 冰乙酸 3:1）于試管中，混勻。

5、1000rpm離心10 min，去上清，輕輕吹打懸浮細胞，室溫下緩慢加入5ml固定液（甲醇 : 冰乙酸 3:1）固定 10 min。

6、1000rpm離心10 min，去上清，輕輕吹打懸浮細胞，室溫下緩慢加入5ml固定液（甲醇 : 冰乙酸 3:1）固定10min。

滴片及預處理程序

1、將收集到的細胞，1000rpm離心10 min，棄上清至原體積的1/50或1/100體積（例如：原羊水體積為2ml, 管內剩余固定液體積為40-50μl）。

2、滴片時重新吹打懸浮細胞，滴片應緊靠玻片滴加。（根據(jù)自己實驗選擇滴片的數(shù)量）

3、放置于56℃烘箱中老化玻片20min或室溫下過夜老化玻片。（注：該玻片可在常溫下保存2周，或在-20℃密封保存一個月）。

4、將玻片置于2×SSC（pH 7.0）溶液中，65℃煮片30min。（注：2×SSC使用前需預熱至60℃）

5、將玻片依次置于-20℃預冷的70%乙醇、85％乙醇中，100％乙醇各2 min脫水。自然干燥玻片，也可以用dd水稍稍沖洗一次。

6、按照 FISH 操作步驟進行 FISH 實驗。

FISH操作步驟

FISH程序可分為主要幾個步驟:變性、雜交、氧化后洗滌和結果分析及評價。

1、玻片晾干后，加入提前配好的雜交液（取3μl預混的雜交液中添加Cy3-DUTP紅色染料和Fluorescein-DUTP綠色染料各0.5μl混勻及相對的引物各0.5μl）；雜交液可加在蓋玻片（5nm×5nm）上每個玻片加4-5μl即可，隨后將蓋玻片覆蓋在滴片處。

注：雜交液里面的Cy3-DUTP和Fluorescein-DUTP染料需要在暗室或者避光操作，

2、利用封片膠進行封片（盡量全封），置于82℃變性10min。

3、將玻片置于濕盒中，37℃雜交雜交2-3h或者雜交過夜。

4、雜交結束后，去掉封片膠和玻片，使用預熱的0.3%NP40/0.4xSSC，72℃浸泡4min。

5、接著利用0.1%NP40/2xSSC，室溫浸泡4min；用dd水沖洗玻片。

6、DAPI染色1min，用100％乙醇洗滌玻片，晾干后用50%甘油封片觀察.

7、FISH檢測結果分析

FISH結果觀察

1、判斷標準 ：

1）隨機計數(shù)細胞（至少計數(shù)50個細胞）：

2）若90%以上的細胞顯示正常信號類型則提示為正常樣本；

3）若60%以上細胞出現(xiàn)異常信號類型則提示為異常樣本；

4）若無法判斷則擴大計數(shù)至100個細胞，以判斷zui后結果。

2、常見異常類型：染色體三體。

1）正常細胞：單個間期細胞核中紅色及綠色信號各2個。

2）異常細胞：

單個間期細胞核中紅色信號為3，綠色信號為2，表示21號染色體三體；

綠色信號為3，紅色信號為2，表示13號染色體三體；

紅色信號為3，綠色信號為3，表示21 號及13 號染色體同時三體。

探針組合2：CSP 18 / CSP X / CSP Y 標記顏色：天藍/綠/紅

3、常見異常類型：18號染色體三體，X或Y染色體非整倍體。

1）正常細胞：

男性單個間期細胞核中天藍色信號2個，紅色信號與綠信號各1個；

女性單個間期細胞核中天藍色信號2個，綠信號2個。

2）異常細胞：

4、陽性判斷值

1）探針組合1：GLP 13 / GLP 21 ，正常單個間期細胞核中紅色及綠色信號各2 個。

2）探針組合 2：CSP 18 / CSP X / CSP Y，男性正常單個間期細胞核中天藍色信號2個，紅色信號與綠色信號各1個；女性正常單個間期細胞核中天藍色信號 2個，綠信號2個。

（三）檢驗標準及注意事項

產品性能指標

1、外觀

GLP 13 / GLP 21 探針溶液應為澄清、透明的粉色液體，CSP18 / CSPX / CSPY

探針溶液應為澄清、透明的淺粉色液體；雜交緩沖液應為澄清、透明的粘稠狀液體。

2、熒光原位雜交探針熒光信號強度

熒光原位雜交探針在外周血淋巴細胞或羊水細胞中均應發(fā)出在鏡下可被肉眼識別的信號。

3、熒光原位雜交探針質量判斷（在外周血淋巴細胞中期分裂相染色體上進行）熒光原位雜交探針敏感性

1）GLP 13 / GLP 21 熒光原位雜交探針敏感性

分析50個中期分裂相中100條13號染色體，應至少有98條（98%）顯示一個綠色熒光信號（DLEU 2 位點）；分析50個中期分裂相中100條21號染色體，應至少有98條（98%）顯示一個紅色熒光信號（DSCR2 位點）。

2）CSP18 / CSPX / CSPY 熒光原位雜交探針敏感性

分析50個中期分裂相中100條18號染色體，應至少有98條（98%）顯示一個藍色熒光信號（著絲粒位點）；分析正常男性50個中期分裂相中100條性染色體，應至少有49條（98%）顯示一個綠色熒光信號（X 染色體著絲粒位點），且應至少有49 條（98%）顯示一個紅色熒光信號（Y 染色體著絲粒位點）。

4、熒光原位雜交探針特異性

1）GLP 13 / GLP 21 熒光原位雜交探針特異性

分析50個中期分裂相中100條13號染色體，應至少有98條（98%）雜交到13號染色體的 DLEU 2 位點；分析50個中期分裂相中100條 21 號染色體，應至少有98條（98%）雜交到21號染色體的DSCR 2 位點。

2）CSP18 / CSPX / CSPY 熒光原位雜交探針特異性

分析50個中期分裂相中100條18號染色體，應至少有98條（98%）雜交到18號染色體的著絲粒位點；分析正常男性50個中期分裂相中100條性染色體，應至少有49條（98%）雜交到X染色體的著絲粒位點，且至少有49條（98%）雜交到Y染色體的著絲粒位點。

5、熒光原位雜交探針對羊水細胞檢測有效性判斷

1）GLP 13 / GLP 21 熒光原位雜交探針檢測正常人羊水細胞有效性判斷

分析4例正常人羊水細胞，與GLP 13 / GLP 21熒光原位雜交探針雜交后，顯示 2個DLEU 2 位點信號及2 個DSCR2 位點信號的細胞數(shù)應不低于90%。

2）CSP18 / CSPX / CSPY 熒光原位雜交探針檢測正常人羊水細胞有效性判斷分析4例正常人羊水細胞，與CSP18 / CSPX / CSPY 熒光原位雜交探針雜交后，顯示2個18號染色體、2個X染色體（女性）或1個X染色體、1個Y染色體（男性）著絲粒信號的細胞數(shù)應不低于 90%。

6、熒光原位雜交探針檢測患者羊水細胞有效性判斷

1）GLP 13/GLP 21熒光原位雜交探針檢測13號染色體三體或21號染色體三體患者羊水細胞有效性判斷至少分析2例13號染色體三體患者羊水細胞，顯示3 個DLEU2位點信號的細胞數(shù)應不低于60%；至少分析2例21號染色體三體患者羊水細胞，顯示3個DSCR2位點信號的細胞數(shù)應不低于60%。

2）CSP18/CSPX/CSPY熒光原位雜交探針檢測18號染色體三體或性染色體數(shù)目異?；颊哐蛩毎行耘袛嘀辽俜治?例18號染色體三體患者羊水細胞，顯示3個著絲粒信號的細胞數(shù)應不低于60%；至少分析2例X染色體異?；颊哐蛩毎?，顯示異常（女性：47，XXX或45，XO，男性：47，XXY）的細胞數(shù)應不低于60%；至少分析2例Y染色體異?；颊哐蛩毎@示異常（47，XYY）的細胞數(shù)應不低于 60%。

7、穩(wěn)定性

試劑盒 37℃放置 7 天或在有效期末，不影響產品的性能指標。

注意事項

1、將羊水收集在不含EDTA的培養(yǎng)基中，因為EDTA是一種螯合劑，可以去除膠原蛋白酶活性所需的鈣離子。

2、在剝離絨毛膜絨毛的過程中，使用專用的溶劑或1×PBS，以防止組織粘連導致細胞丟失。

3、預先處理過的載玻片可立即雜交或在室溫下保存3周。如果需要長期存儲，則需置于-20℃可放置幾個月。

4、在清洗過程中，重要的是要防止樣品表面干燥，否則會出現(xiàn)背景問題

5、雜交過程中，盡量佩戴無粉手套，以防止污染樣片，出現(xiàn)背景雜點

6、雜交所用的試劑盡量現(xiàn)配現(xiàn)用

7、結果分析注意事項：計數(shù)細胞必須是各通道信號均清晰可辨的細胞；雜交不均勻的區(qū)域和細胞核輪廓不清或有重疊及背景深導致影響信號判斷的區(qū)域的不需要分析。

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